共聚焦顯微鏡是一種利用點光源照射、點探測器接收，并通過共軛針孔消除離焦光干擾的高分辨率光學成像技術。它突破了傳統(tǒng)寬場熒光顯微鏡的分辨率限制，尤其擅長三維成像、光學切片和活細胞動態(tài)觀測，是生命科學、材料科學等領域的重要工具。
 

　　一、核心原理：共軛聚焦與光學切片
 

　　1.點照明： 激光光源發(fā)出的光束通過照明針孔，聚焦成非常小的點照射到樣本的特定焦平面上的一個點。
 

　　2.點探測： 樣本被激發(fā)產(chǎn)生的熒光(或反射光)信號，只有來自焦平面的信號才能精確地通過探測針孔到達探測器(通常是光電倍增管PMT或雪崩光電二極管APD)。
 

　　3.消除離焦光： 來自樣本非焦平面(上方或下方)的散射光或熒光信號，在通過探測針孔時會被阻擋，無法到達探測器。這就是共軛針孔(照明針孔和探測針孔共軛) 的核心作用。
 

　　4.掃描成像： 為了獲得整幅圖像，聚焦的激光點需要通過掃描振鏡系統(tǒng)在樣本的X-Y平面上進行逐點掃描。探測器在每個掃描點同步記錄光強信號。
 

　　5.光學切片： 通過精確控制物鏡的Z軸位置(上下移動樣本或物鏡)，可以在樣本的不同深度獲取一系列清晰的二維圖像(X-Y平面圖像)。這些圖像被稱為光學切片。
 

　　6.三維重建： 將采集到的一系列光學切片通過計算機軟件進行疊加和處理，即可重建出樣本的高分辨率三維結構。
 

　　二、關鍵組件
 

　　1.激光光源： 提供高強度、單色性好、方向性好的激發(fā)光。通常配備多個不同波長的激光器，用于激發(fā)不同的熒光染料。
 

　　2.掃描裝置：
 

　　掃描振鏡： 核心部件，通常是兩個高速振動的反射鏡(X軸和Y軸)，精確控制激光束在樣本表面的掃描路徑。
 

　　掃描透鏡與管透鏡： 確保掃描光束精確聚焦在物鏡的后焦面，實現(xiàn)無畸變掃描。
 

　　3.分光鏡/二向色鏡： 將激發(fā)光反射到樣本方向，同時允許樣本發(fā)射的熒光透射到探測光路。需要根據(jù)所用熒光染料的激發(fā)和發(fā)射光譜選擇合適的鏡片。
 

　　4.物鏡： 高質(zhì)量、高數(shù)值孔徑(NA)的物鏡至關重要，它決定了系統(tǒng)的分辨率、光收集效率和成像深度。
 

　　5.共軛針孔：
 

　　照明針孔： 位于光源后，將激光變成點光源。
 

　　探測針孔： 位于探測器前，阻擋離焦光。針孔大小可調(diào)，是控制光學切片厚度和圖像信噪比的關鍵參數(shù)(小針孔切片薄、分辨率高但信號弱；大針孔切片厚、信號強但分辨率降低)。
 

　　6.探測器： 通常是高靈敏度的光電倍增管或雪崩光電二極管，將微弱的光信號轉換為電信號。
 

　　7.計算機控制系統(tǒng)： 控制掃描、Z軸移動、激光強度、針孔大小、探測器增益、圖像采集和處理等所有參數(shù)。
 

　　8.熒光濾光片組： 位于探測光路中，進一步阻擋殘留的激發(fā)光和其他波長的雜散光，確保探測到的是特定發(fā)射波長的純凈熒光信號(發(fā)射濾光片)。
 

　　三、主要優(yōu)勢
 

　　1.高軸向分辨率(Z分辨率)與光學切片能力： 這是突出的優(yōu)勢。能清晰區(qū)分樣本中不同深度的結構，獲得樣本內(nèi)部不同層面的清晰圖像，無需物理切片即可進行三維成像。
 

　　2.高對比度： 有效抑制離焦背景光干擾，顯著提高圖像的清晰度和信噪比，特別適合觀察厚樣本或弱熒光信號。
 

　　3.高分辨率： 相比傳統(tǒng)寬場熒光顯微鏡，共聚焦顯微鏡的X-Y平面分辨率也有一定提升(約1.4倍)，尤其在利用某些技術后分辨率可接近光學衍射極限。
 

　　4.三維重建： 可對活體或固定樣本進行非侵入性的三維結構解析。
 

　　5.多通道成像： 可同時或依次使用不同波長的激光激發(fā)不同的熒光標記物，實現(xiàn)多色標記樣本的多通道成像，研究不同分子或結構的共定位。
 

　　6.活細胞成像： 減少光毒性和光漂白(相對于寬場需要更短的曝光時間獲取清晰圖像)，結合合適的培養(yǎng)系統(tǒng)，可用于長時間觀察活細胞內(nèi)的動態(tài)過程。
 

　　7.圖像后處理： 強大的軟件支持進行三維可視化、表面渲染、體積測量、共定位分析、熒光強度定量分析等。
 

　　四、主要應用領域
 

　　1.細胞生物學：
 

　　細胞器結構與動態(tài)(線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、細胞骨架)。
 

　　細胞膜結構與流動性。
 

　　細胞內(nèi)離子濃度(如Ca²?, pH)成像。
 

　　基因表達與蛋白定位。
 

　　細胞間相互作用(如免疫突觸)。
 

　　細胞遷移與分裂。
 

　　2.神經(jīng)科學：
 

　　神經(jīng)元形態(tài)與樹突棘結構。
 

　　神經(jīng)網(wǎng)絡連接。
 

　　突觸結構與功能。
 

　　神經(jīng)遞質(zhì)釋放與受體分布。
 

　　3.發(fā)育生物學： 胚胎發(fā)育過程的三維形態(tài)發(fā)生、基因表達模式。
 

　　4.病理學與臨床診斷：
 

　　組織病理學切片分析(提供比普通光鏡更豐富的亞細胞信息)。
 

　　皮膚科在體共聚焦顯微鏡用于無創(chuàng)診斷皮膚病(如黑色素瘤)。
 

　　5.免疫學： 免疫細胞激活、遷移、與靶細胞的相互作用。
 

　　6.微生物學： 細菌、真菌在宿主細胞內(nèi)的生存、生物膜結構。
 

　　7.植物學： 植物細胞結構、細胞壁、葉綠體、基因表達。
 

　　8.材料科學： 材料表面形貌、涂層厚度、薄膜結構、微電子器件檢測、高分子材料結構等(常使用反射模式)。